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              技術與支持

              SUPPORT

              如何選擇流式抗體

              如何選擇流式抗體,我們建議您從以下六個方面進行考慮:

              1. 滿足抗體選擇的基本條件
              靶蛋白特異性:確定目的細胞的特異性表面標記或者胞內標記,清楚您要檢測什么。
              種屬:嚴格按照待測樣本種屬選擇抗體來源,流式抗體基本無種屬間交叉反應。
              應用領域:可用于流式實驗,說明書中明確標注經FC實驗測試,最好有實驗數據圖和用量說明。
              抗體克隆號:一般選擇參考文獻上提到的克??;同一抗體多個克隆號的情況下,可以選擇熒光標記種類最多的那個克隆。

              2. 確定流式細胞儀的參數配置

              在設計流式檢測方案前,根據可能需要同時檢測指標的數量,先確定流式細胞儀的型號,對該儀器的參數配置,要了解以下幾個方面的信息:
              激光器:常見的流式細胞儀有488 nm和633 nm兩個激光器,但有些機器在購買時因某些原因,只裝了一個488 nm激光器,所以需要注意型號相同的機器也未必激光配置相同。
              濾光片:也就是有幾個檢測通道,這決定了你最多可以同時檢測幾個指標。
              儀器的具體型號:有助于再次確定檢測通道。因為同一個熒光在不同的流式細胞儀上檢測,有時候檢測通道也是不一樣的。

              3. 熒光的選擇建議
              直標還是間標:待測抗原表達豐度高的盡量選擇直標抗體,待測抗原表達豐度低的需要考慮選生物素標記抗體。
              熒光強弱: 熒光本身有強弱之分,可視抗原表達強弱及分群情況選擇合適的熒光。如抗原表達豐度弱或分群不明顯的建議選擇強熒光,例如:PE、APC;反之,抗原表達豐度強或分群明顯的建議選擇最常用的弱熒光,例如FITC即可(常用熒光強弱程度排序為:PE>APC>PE/Cy5>PerCP/Cy5.5>FITC)。
              類似熒光的權衡:可以嘗試選擇新型熒光Alexa Fluor、eFluor等。因為這些熒光非常明亮,對激光穩定性好,對PH 值不敏感,具有水溶性(如Alexa Fluor488與FITC檢測通道相同,但是熒光強度和光敏感上,前者明顯優于后者)。

              4. 多色熒光搭配的原則
              多色分析方案中熒光抗體的選擇和搭配,會受到很多因素的制約,是個難點。
              檢測通道不能沖突:每個檢測通道只能選擇1種熒光素,各通道之間的熒光素可以隨意搭配(如FL1選擇了FITC標記的抗體,就不能再選擇Alexa Fluor488標記的抗體;而同組實驗的其余抗體選擇PE或者APC標記,都可以隨意組合)。
              熒光強弱:所選各種熒光素光譜的重疊應當盡量減少,否則將會導致較大的補償。例如,PE/Cy5與APC同時標記,將會導致補償過度,需換成PE/Cy5.5或PerCP/Cy5.5。最常用的熒光搭配是:FITC、PE、PerCP、PerCP/Cy5.5、APC。
              多色熒光搭配:多色分析往往會因個別抗體熒光素種類極少而受到限制,需要同時參考多家抗體公司的產品進行方案設計。因此如遇5色以上分析需求,建議咨詢三箭生物技術支持。

              5. 抗體使用劑量
              同一個產品通常會提供多個規格供您選購,可以根據實驗的具體樣本量和說明書建議用量來確定抗體用量:
              細胞數:通常情況下流式檢測一次的樣本量為10^6~10^8個細胞,建議對樣本做細胞計數,以保證抗體標記效果最佳;
              包裝:以test為計量單位的抗體,按照每test細胞懸液體積計算出每次加入多少體積抗體即可; 以ug為計量單位的抗體,需要根據說明書計算出每次加入多少體積的抗體。

              6. 同型對照抗體的選擇
              同型對照(Isotype Control),是用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色,是真正意義上的流式陰性對照,流式細胞實驗不可或缺的一項。
              來源:同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標記的免疫球蛋白,也要求使用相同劑量。同型對照一定要選擇準確,通常在熒光一抗的說明書中,廠家會給出同型對照抗體的貨號;
              純化級別抗體:如果是純化的一抗加熒光標記的二抗,那么應該選擇與一抗相對應的同型對照抗體(如樣品管為:純化的CD3+PE標記的二抗+樣本;則對照管為:純化的同型對照+ PE標記的二抗+樣本)。
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              上一篇:沒有了

              下一章:Annexin V測細胞凋亡發布時間: 2015-12-16

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