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              技術與支持

              SUPPORT

              細胞表面染色

              細胞準備:
              1. 采集組織(peizang,淋巴結,胸腺和骨髓),用細胞染色buffer制成單細胞懸液。對于體外刺激的細胞,直接將刺激后的細胞懸浮于細胞染色buffer中。
              2. 加入細胞染色buffer至15 mL, 350×g 離心細胞懸液5分鐘,棄上清。

              紅細胞裂解:
              3. 如果需要裂解紅細胞(如peizang),將10×紅細胞裂解液(RBC)用H2O稀釋為1×RBC,放置到室溫。將細胞重懸于3 mL 1×RBC中,室溫孵育5分鐘。
              4. 加入10 mL細胞染色buffer終止紅細胞裂解,350×g 離心細胞懸液5分鐘,棄上清。
              5. 重復洗滌一次,同步驟2。
              6. 細胞計數,用細胞染色buffer將細胞制成1×107個/mL懸液。取100 μL細胞懸液加入流式管中備用。

              封閉Fc受體:
              7. 封閉Fc受體能減少染色過程中的非特異性染色。小鼠中,純化的CD16/CD32單抗能和FcγRⅢ/Ⅱ結合,封閉非特異性染色。加入5-10 μg/mL FcγRⅢ/Ⅱ封閉液,冰上孵育10分鐘。

              細胞染色:
              8. 按照說明書的推薦用量加入熒光標記的抗體,混勻后置于冰上,避光孵育30分鐘。
              9. 加入5mL FACs buffer重懸細胞,350×g 離心細胞懸液5分鐘,棄上清。
              10. 加入0.5mL FACs buffer重懸細胞,用流式細胞儀進行檢測和分析。

              注意事項:
              1. 抗體使用前,建議快速甩動一下,使之聚集到管底;
              2. 熒光標記的抗體應于4℃避光保存,請勿冷凍;
              3. 樣品經多聚甲醛固定或染色后延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結果,建議染色后盡快上機檢測。
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              下一章:iFlour熒光染料介紹發布時間: 2015-12-18

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