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              技術與支持

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              流式凋亡實驗你做對了嗎

               

              細胞凋亡(apoptosis)指為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同,細胞凋亡不是一件被動的過程,而是主動過程,它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用,它并不是病理條件下,自體損傷的一種現象,而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。

              檢測凋亡的方法很多,其中磷脂酰絲氨酸外翻分析法是最常用的一種方法。其原理是:磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一種Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素標記,以標記了熒光素nexin-V作為探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過細胞膜而使細胞核染色。因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。


              我們公司在Annexin-V/PI試劑盒的基礎上進行了產品升級,加入了凋亡陽性誘導劑,主要是為了方便客戶調節補償。當檢測細胞凋亡的時候,如果發生凋亡的細胞較少,那么沒有明顯的陽性群,我們調節補償的時候會比較困難。如果補償調節不當,將影響后續數據的分析。而陽性誘導劑的使用則避免了以上的情況。


              下面對我們試劑盒的使用方法(以Annexin V-FITC/PI試劑盒為例)進行一下介紹:

              單染管處理:

              1,取1×106 -3×106個細胞(實驗中未做任何處理的細胞),將細胞平均分到兩支流式管中,加入4ml 1X PBS,對細胞進行清洗,300×g/分鐘,離心10分鐘,去上清。

              2,其中一管加入200ul 1X binding buffer,保存在4℃備用。

              3,另一支流式管中加入500ul 陽性誘導劑,室溫放置10分鐘。加入3ml 1X PBS,300×g/分鐘,離心10分鐘,去上清。再加入4 ml 1X PBS,300×g/分鐘,離心10分鐘,去上清。剩余細胞加入200ul 1X binding buffer重懸。

              4,將兩支流式管細胞混合,然后分到3個流式管中,每管100ul。

              5,第一支管為空白對照,第二支管加入5ul Annexin V-FITC,第三支管加入5ul PI,將流式管置于室溫,避光染色5分鐘。

              6,加入300-500ul PBS,混勻上機,調節儀器電壓和補償。

              【注意:以上單染管只用于儀器調節補償,實驗組細胞不得使用陽性誘導劑處理】

               

              實驗組細胞染色:

              1,使用1×105 ~1X106個細胞,加入4ml 1X PBS,對細胞進行清洗,300×g/分鐘,離心10分鐘,去上清。

              2,加入 100ul 1X binding buffer重懸細胞。

              3,加入5ul Annexin V-FITC與細胞中,混勻,室溫避光染色10分鐘。

              4,再加入5ul PI,混勻,室溫避光染色5分鐘。

              5,加入300-500ul PBS,混勻上機。

              【注意:上機實驗應在染色后1小時內完成】


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